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產(chǎn)品編號：SR704

制品內(nèi)容（25μl反應(yīng)×50次量）

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2×Premix for PCR *1                   1 ml

Primer Mix for Equine*2                50μl

dH₂O                                         1 ml

Control DNA for Equine                50μl

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*1   2×Premix for PCR中含有dNTP、Buffer、Taq酶等。

*2   Primer Mix for Equine中含有擴(kuò)增用引物。

保存：-20℃

制品說明

本制品是利用PCR技術(shù)快速檢測馬線粒體DNA的試劑盒。應(yīng)用PCR技術(shù)，根據(jù)線粒體基因上動(dòng)物種間的多態(tài)性的差異進(jìn)行馬源性成分鑒定。
利用特異性擴(kuò)增馬源性成分的引物對樣品模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并分別在實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陰性對照和陽性對照反應(yīng)。制品中2×Premix for PCR
已經(jīng)將DNA聚合酶、反應(yīng)用Buffer、dNTP等試劑預(yù)混在一起。試劑盒采用獨(dú)特的PCR反應(yīng)用Buffer和DNA聚合酶,可以有效抵制非特異性的PCR
擴(kuò)增，大大提高了PCR的擴(kuò)增效率。本檢測簡單快速，靈敏度高、特異性強(qiáng)。本制品適用于食品和飼料等樣品中馬源性成分的鑒別。

實(shí)驗(yàn)操作

A  樣品DNA 提取：

1．取樣：按采樣要求，取8-10g原樣品在滅菌研缽中。

2．研磨：加入適量TE溶液，充分研磨樣品至微小顆粒狀，轉(zhuǎn)移至數(shù)個(gè)滅菌EP管中。

3．提取核酸：按市售的DNA核酸提取試劑盒的說明方法提取樣品總DNA。

B  PCR反應(yīng)

按下列組份配置PCR反應(yīng)液。

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2×Premix for PCR                    18μl

Primer Mix for Anatine            1μl

樣品DNA  *                                  5μl

dH2O                                up to 25μl

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*  Negative Control 反應(yīng)時(shí)，用dH2O替代樣品DNA; Positive Control 反應(yīng)時(shí)，用Control DNA for Equine替代樣品DNA。

C  凝膠電泳檢測試驗(yàn)：

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳試驗(yàn)。

按下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng):

   94℃                2  min      1 Cycle

   94℃               15  sec     40 Cycles

   68℃               30  sec     40 Cycles

   72℃               30  sec     40 Cycles

   72℃                5  min      1 Cycle

質(zhì)量控制

以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無效：

a)       空白對照：無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。

b)       陰性對照：在226bp大小處未見PCR擴(kuò)增條帶。

c)       陽性對照：在226bp大小處可見PCR擴(kuò)增條帶。

結(jié)果判斷與表述

A  結(jié)果判定

在符合質(zhì)量控制的情況下，被檢樣品在226bp大小處可見PCR擴(kuò)增條帶則判為可疑陽性；在226bp大小處未見PCR擴(kuò)增條帶則判為陰性。

將可疑陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測定，與馬線粒體細(xì)胞色素C氧化酶Ⅲ基因相對應(yīng)片段的序列比對，其片段大小正確，同源性
達(dá)到97%以上，則確證含有馬成分。

B  結(jié)果表述

結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出馬成分”。